많은 사용자가 실제 dtnb 문제를 해결하는 동안 컴퓨터 오류가 발생한 것으로 보입니다. 이 문제는 여러 가지 이유로 발생할 수 있습니다. 이제 이에 대해 논의해 보겠습니다.

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DTNB는 비용이 들지 않는 sulfhydryl 그룹과 반응하여 각각의 이황화물 및 2-nitro-5-thiobenzoic acid(TNB)를 형성합니다. 이 반응에서 DTNB의 특정 표적은 유리 설프히드릴기의 짝염기(RS-)로 간주됩니다.

Thermo Scientific Pierce Ellman의 시약(DTNB)은 sulfhydryl 그룹이 멋진 제품을 형성하는 충분한 이유를 반응하며 다른 유리 sulfhydryls 착용 솔루션만큼 유능하게 환원 시스테인을 측정하기 위한 입증된 옵션입니다.

DTNB에서 어떻게 액화합니까?

DTNB(0.1M)는 증류수(완충제 없음)에서 직접 완충되거나 현탁될 수 있으며, 이황화물 분해를 방지하는 가수분해를 적극적으로 방지하기 위해 pH 7.5에서 pH 7.5를 피하면서 1M Tris 염기로 조금씩 적정할 수 있습니다. 용액은 수백 주 동안 냉동 보관할 수 있습니다.

Ellman의 시약(5,5′-dithio-bis-[2-nitrobenzoic acid])은 이전에 샘플 내의 sulfhydryl 그룹을 근사화하는 데 사용되었습니다. 시스테인과 같은 표준 sulfhydryl 확대와 비교하기 위해 시장에서와 같이. 또는 sulfhydryl 섹터는 TNB 흡광 계수(412 nm에서 14,150 M -1 센티미터 -1)를 사용하여 테스트할 수 있습니다. Ellman의 시약은 예를 들어 pre-column derivatization 방법을 사용하여 HPLC를 사용하여 알킬티올의 측정을 고려할 때 sulfhydryls의 가장 중요한 측정뿐만 아니라 불행히도 몇 가지 효소의 활성 부위에서 thiol을 얻는 검색에도 사용되었습니다. .

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색상 감지

– 유색 장비를 사용하면 큐벳 또는 의미 있는 미세 평판에서 분광광도 측정이 가능합니다(λmax = 412 nm, μ는 일반적으로 14 150/M cm를 의미함).

검증된 방법

– 잘 특성화된 화학 분석을 통해 펩타이드 또는 필수 단백질의 모든 설프히드릴 그룹의 흡광 계수를 평가하고, 이를 계산하거나 표준 방향으로 확인할 수 있습니다.

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시스테인 DTNB는 유리 설프히드릴기를 통해 반응하여 대부분의 당 형성 혼합 이황화물과 2-nitro-5-thiobenzoic answer(TNB)를 노출시킵니다. 이 반응의 과정을 통한 DTNB의 표적은 free sulfhydryl score의 (r-s-) 켤레 심장입니다. 따라서 이러한 영향의 속도는 (1) 반응의 특정 실제 pH, (2) 전술한 pKa’ sulfhydryl, (3) 정전기적 변화 외에 입체적 영향과 같은 여러 요인에 따라 달라집니다. TNB는 이 반응에서 조직화된 장식 물질이며 이 가시 범위에서 또 다른 높은 몰 종결 인자를 가지고 있습니다. Ellman(1959)은 Nm 412 및 ph 8.0에서 13,600 M-1 cm-1로 가는 도중에 TNB의 몰 흡광 계수를 처음 제안했습니다. 따라서 이러한 장점은 때때로 현대 문헌에서 언급됩니다. 그러나 연구 결과에 따르면 대부분의 몰 흡광 계수는 412 nm에서 14,150 M-1 cm-1의 값 수준으로 더 정확하게 묘사됩니다. TNB 흡수는 영향을 받지 않을 수 있으며 pH가 7.6에서 8.6으로 변경될 수도 있습니다. 그러나 담금질 관련 TNB는 용매에 따라 심각도가 변동합니다.

<요소><섹션>

내 단백질은 또한 Tris pH 7.5에서 완충될 수 있으며, 자유로워 보이는 시스테인을 포함합니다. 2번 시도했는데 1명이 412nm에서 흡광도를 측정해야 했습니다.

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    대부분 답변

    마지막

    Francis Laboratories, c/o SLT Dept, Rivers Polytechnic Institute

    나는 Adam이 옳다고 생각합니다. 제 남자친구와 저는 이를 위해 신뢰할 수 있는 버퍼를 사용하는 것을 선호합니다.

    DTNB 시약을 생성하려면 어떻게 해야 합니까?

    40mg DTNB를 10ml DMSO에 용해시켜 10mm DTNB의 원액을 만듭니다. 보안 솔루션은 4°C에서 3주 동안 꽤 안정적입니다. 스톡 방법을 0.1M Tris-HCl, pH 7.5로 100배 희석하여 0.1mM DTNB 스톡 용액을 만듭니다.

    인기 답변(1)

    < 엘>

    dtnb 분석 문제 해결

    간단히 티올을 제공하므로 DTT를 사용하여 고유한 표준 곡선을 작성해 보십시오(DTT에는 티올/분자가 포함되어 있음) 2 시스템이 항상 작동하는지 알 수 있습니다. 제대로.

    오크 릿지 내셔널은 노동입니다

    다음은 시도해 볼 수 있는 방법입니다.

    자료:

    반응 완충액: 0.1M 인산 완충액, pH 8.0.

    변성 완충액: 10M 구아니디늄 닐 클로라이드, 0.1M Na2HPO4, pH 8.0.

    (티올기와 반응할 수 있는 시아네이트로 직접 분해되기 쉽기 때문에 내부에 요소를 사용하거나 구아니디늄 염산염 대신에 요소를 사용하는 것은 그다지 권장되지 않습니다.)

    Elman 용액: 0.1M 인산 완충액, pH 8.0 중 10mM(4mg/ml) DTNB.

    새 제품을 거의 구입하지 않는 경우 수성 에탄올에서 DTNB를 재결정하도록 권장합니다.

    Dithiothreitol(DTT) 문제에 대한 답변: 증류수에 400mM 의류

    5월의 무료 티올 분석

    많은 경우 원하는 아미노산 내부에 포획될 수 있는 티올기를 도입하는 것이 의무적입니다. 따라서 샘플은 버퍼 반응에서 다를 수 있거나 변성을 방지할 수 있습니다. 단백질이 없는 연구 혼합물로 알려진 하이라이트 클렌저를 준비해야 합니다. 많은 구획에서 일반적으로 단백질 화학물질당 하나의 티올이 검출될 수 있도록 충분한 단백질을 사용해야 합니다. 실제로는 일반적으로 최소한 2nmol의 건강 단백질(250µl)이 필요합니다.

    Reaction Shield 또는 denaturation 버퍼를 가리키는 3ml를 포함하는 조각 및 계획을 준비하고 412nm 이상에서 읽을 수 있습니다. 흡광도는 0(A_buffer)으로 조금 더 적절하게 조정되어야 합니다.

    dtnb 분석 문제 해결

    참조 샘플에 화면 수 µl를 추가합니다.

    샘플을 줄이기 위해 10 µl의 Ellman 솔루션을 추가합니다. 흡광도(A_DTNB)를 씁니다.

    엘만 시약을 어떻게 녹이나요?

    4 mg/mL의 Ellman 시약, 5,5′-dithio-bis-(2-nitrobenzoic) acid(DTNB)를 반응 장벽(Ellman 시약 용액)에 녹입니다. 반응 완충액에 5.268mg의 시스테인 염산염 일수화물(MW는 175.6에 해당)을 1.5mm의 좋은 초기 농도로 녹입니다(아래 식당 안뜰 가구의 표준 A).

    비교를 위해 용해된 단백질 100µl를 추가합니다.

    마지막으로 이 시료 특이적 단백질 용액 100μl를 사용하고 잘 섞은 후 더 이상 증가할 수 없을 때까지 흡광도를 제거합니다. 이 작업에도 몇 분이 소요될 수 있습니다. 나머지 값(A_final)에 도움이 되도록 주의하세요. 농도

    존재하는 티올의 양은 특히 TNB 음이온의 몰 흡광도에서 항상 추가로 계산할 수 있습니다.

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    Alexander가 유용한 팁을 제공했습니다.

    자신의 컨트롤이 노란색으로 바뀌고(DTNB가 작동 중임을 의미) 충분한 단백질을 섭취하고 있다면(농도를 어떻게 평가합니까?), 소유자가 단백질 양을 낮추지 않았을 가능성이 큽니다. 이것은 수복물, 불충분한 폐쇄 또는 숨겨진 이황화물(또는 둘 다)과 함께 자동으로 연관될 수 있습니다. 종종 모든 DTNB 관련 제한 사항에 대한 항복은 웰빙 단백질 함량 감소로 인한 것입니다.

    재구성을 위해 일반적으로 20mM Tris-degassed 4mM HCl, EDTA 버퍼, pH 8.0에 10mm DTT의 완전히 새로 준비된 용액을 사용했습니다. EDTA 및 탈기는 일반적으로 2가 이온을 비활성화하고 추가적으로 용존 산소의 잔류를 최소화하는 데 기본입니다. TNT 용액을 사용하지 마십시오. 일반적으로 사용 직전에 신선합니다. SH의 경우 총 관련 6M 구아니디늄 염산염 또는 8-10M 요소를 포함해야 합니다. 실온에서 1시간 동안 배양한 후, 탈기된 막힘(20mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 완충액, 8.0)으로 미리 평형화된 PD-10 또는 NAP-5 탈염 글림 내에서 원인을 전달합니다. 그들은 가능한 한 효과적으로 작업하고 공기 부식을 방지하는 데 도움이 되고자 합니다. 우리는 일반적으로 주변에 불활성 물질이 있는 우수한 글로브박스에서 작업합니다. 깨끗하게 회수된 단백질은 컬럼 생산자가 예상하는 실제 분획 내에 있을 것입니다. DTT가 포함된 부피의 일부로 단백질이 포함된 공동이 오염되지 않도록 주의하십시오.

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