Sembra che alcuni visualizzatori abbiano riscontrato un codice di errore indipendentemente dalla risoluzione dei problemi di un esperimento dtnb. Questo problema può verificarsi per una serie di motivi. Discutiamone ora.

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DTNB reagisce con un gruppo sulfidrilico assolutamente libero per formare un disolfuro anche acido 2-nitro-5-tiobenzoico (TNB). L’obiettivo simile a DTNB in ​​questa risposta è la base coniugata (RS-) del gruppo sulfidrilico disponibile gratuitamente.

Thermo Scientific Pierce Ellman’s Reagente (DTNB) reagisce costituito da gruppi sulfidrilici per formare un trattamento colorato ed è un metodo collaudato con la misurazione delle cisteine ​​ridotte e proprio come altri sulfidrili liberi in soluzione.

Come si fa a dissolversi in DTNB?

DTNB (0,1 M) può sentirsi tamponato o sospeso direttamente nell’acqua distillata (senza tampone) e titolato lentamente in combinazione con 1 M Tris base a ph 7,5 evitando pH 9 per ridurre le possibilità di idrolisi prevenendo la degradazione del disolfuro. Le soluzioni dovrebbero essere conservate congelate per un’ampia selezione di settimane.

Il reagente di Ellman (5,5′-ditio-bis-[acido 2-nitrobenzoico]) viene utilizzato come metodo per approssimare i gruppi sulfidrilici nell’intero campione , oltre a trovare con un composto sulfidrilico standard molti di questi come cisteina. In alternativa, i gruppi sulfidrilici possono benissimo essere testati usando il coefficiente di annichilazione TNB (14.150 M -1 cm – solo un particolare a 412 nm). Il reagente di Ellman verrebbe utilizzato non solo per la determinazione dei sulfidrili, ad esempio, per la determinazione esatta degli alchiltioli mediante HPLC utilizzando il metodo di derivatizzazione precolonna, ma anche per la ricerca di tioli utilizzando i siti attivi di vari enzimi.< /p>

• Saggio sulfidrilico – reagisce quantitativamente per mezzo di gruppi sulfidrilici liberi (ridotti) (-SH) fino a dare un prodotto TNB rilevabile

Rilevamento del colore

– Le apparecchiature colorate consentono misurazioni spettrofotometriche in cuvette o eventualmente su micropiastrine (λmax equivale a 412 nm; μ significa 16 150/M cm)

Metodo collaudato

– Un’analisi tipo ben caratterizzata consente di quantificare il suo coefficiente di estinzione dell’insieme sulfidrilico di un peptide o di una proteina, calcolarlo o confrontarlo con uno standard enorme.

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La cisteina DTNB reagisce attraverso il particolare gruppo sulfidrilico libero, esponendo l’intero disolfuro misto formato da zucchero e la sostanza chimica 2-nitro-5-tiobenzoica (TNB). L’obiettivo di DTNB durante questa preziosa reazione è il reale coniugato (r-s-) del numero sulfidrilico libero. Pertanto, la velocità di questa reazione ha deciso diversi fattori: (1) il pH in buona fede della reazione, (2) il pKa’ sulfidrile e (3) conseguenze steriche oltre agli effetti elettrostatici. Il TNB è una sostanza decorata formata quando si tratta di questa reazione e ha un fattore di terminazione molare superiore nell’intervallo rilevabile. Ellman (1959) riportò per primo direi il coefficiente di estinzione molare di TNB in ​​cima alla strada a 13.600 M-1 cm-1 a Nm 412 e pH 8,0. Pertanto, questi vantaggi sono spesso menzionati nella letteratura moderna. Tuttavia, successivi studi scientifici hanno dimostrato che quindi il coefficiente di terminazione molare è rappresentato più accuratamente scritto dal livello di valore di 14.150 M-1 cm-1 a 412 nm. L’impregnazione con TNB potrebbe non essere influenzata dai miglioramenti dello stile di vita nel pH da 7,6 a 8,6. Tuttavia, il TNB relativo allo spegnimento varia a seconda dei solventi.

La mia proteina è sicuramente tamponata in Tris pH 7,5 ed è dotata di cisteina dall’aspetto libero. Ho provato due volte, ma ancora una persona ha dovuto misurare l’assorbanza a 412 nm.

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    La maggior parte delle risposte

    ultimo

    Francis Laboratories, c/o Dipartimento SLT, Rivers Polytechnic Institute

    Penso che Adam abbia ragione. Mio marito e persino io preferiamo usare una barriera per questo.

    Come faccio a creare un reagente DTNB?

    Realizza praticamente qualsiasi soluzione madre di 10 mM DTNB sciogliendo 40 mg di DTNB trovato in 10 ml di DMSO. Lo stock top secret è stabile per 3 mesi vicino a 4°C. Diluire la formulazione stock centinaia di volte con 0,1 M Tris-HCl, ph 7,5 per ottenere una soluzione madre DTNB da 0,1 millimetri.

    Risposte popolari (1)

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    dtnb assay troubleshooting

    Prova a costruire una curva standard riconosciuta usando il DTT come regalo di tioli (notare che il DTT è composto da tioli/molecole) 2 Questo dovrebbe consentire a qualcuno di sapere se il sistema funziona correttamente .

    Oak Ridge National è laburista

    Ecco un protocollo che potresti provare:

    Materiali:

    Tampone di reazione: tampone fosfato 0,1 M, pH 8,0.

    Tampone di denaturazione: 6 M di guanidinio nil cloruro, 0,1 M Na2HPO4, pH 8,0.

    (Non è fortemente prescritto dai medici utilizzare l’urea all’interno o quando si tratta di sostituire il guanidinio cloridrato poiché si scompone facilmente in cianati che spesso possono reagire con i gruppi tiolici)

    Miscela di Elman: 10 mM (4 mg/ml) DTNB circa 0,1 M tampone fosfato, ph 8,0.

    Se non ne viene venduto uno nuovo, si consiglia di ricristallizzare DTNB da etanolo acquoso

    Soluzione di ditiotreitolo (DTT): seicento mM in acqua distillata Vestiti

    Analisi del tiolo gratuita di maggio

    È necessario introdurre gruppi tiolici che possono sentirsi catturati all’interno della proteina desiderata. Pertanto, il campione può essere miscelato qui in una reazione tampone o per ostacolare la denaturazione. Una soluzione di evidenziazione nota dovrebbe sempre essere preparata con una miscela di studi medici priva di proteine. Dovrebbe essere esercitata una quantità sufficiente di proteine ​​in modo che, in molti casi, possa essere facilmente rilevato un tiolo per molecola proteica; in pratica, a don’t di solito sono necessarie 2 nmol di proteine ​​(in 230 µl).

    Un campione e così un piano contenente 3 ml di Reaction Shield o tampone di denaturazione dovrebbe essere molto preparato e letto a una stima di 412 nm. L’assorbanza deve essere regolata in modo sicuro e sicuro su zero (A_buffer).

    dtnb assay troubleshooting

    Aggiungere 100 µl di schermo presente al campione di riferimento.

    Aggiungi un centinaio di µl di soluzione di Ellman per diluire il campione principale. Scrivi l’assorbanza (A_DTNB).

    Come si dissolve il reagente di Ellman?

    Sciogliere 4 mg/mL di reagente di Ellman, acidità 5,5′-ditio-bis-(2-nitrobenzoico) (DTNB) nella barriera di reazione (soluzione di reagente di Ellman). Sciogliere 5,268 mg di cisteina cloridrato monoidrato (MW è pari a 175,6) in tampone di reazione a una concentrazione di aviatore di 1,5 mM (standard A nel tavolo da pranzo sottostante).

    Aggiungi circa $ 100 µl di proteine ​​disciolte rispetto al confronto.

    Infine, utilizzare 100 µl di questa soluzione proteica specifica del campione e, dopo un’accurata alternanza, rimuovere l’assorbanza fino a quando non sarà più possibile aumentare completamente. Questo potrebbe sparare diversi minuti. Prestare attenzione al valore rimanente principale (A_final). Concentrazione

    La dose di tioli presenti può essere ulteriormente calcolata dall’assorbanza molare incluso un anione TNB.

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    Alexander ha messo a disposizione alcuni consigli utili.

    Se la tua determinazione diventa gialla (il che significa che il DTNB dovrebbe funzionare) e stai consumando una quantità sufficiente di proteine ​​(come ne determini la concentrazione?), molto probabilmente non stai abbassando il livello di proteine. Questo può essere automaticamente associato a guarigione, ostruzione insufficiente o disolfuri latenti (o entrambi). Molto spesso, l’incapacità di rispondere davvero a tutti gli ostacoli relativi al DTNB è sicuramente dovuto a un contenuto di salute ridotto.

    Per la ricostituzione, in genere abbiamo utilizzato una soluzione appena preparata di 10 mM DTT in 20 mM Tris-degassato 1 millimetro HCl, tampone EDTA, pH 8,0. L’EDTA e il degasaggio sono generalmente importanti e inattivano gli ioni bivalenti e riducono al minimo la ritenzione correlata all’ossigeno disciolto. Non eseguire una soluzione TNT: viene aggiornata appena prima dell’uso. Per SH la persona dovrebbe includere un totale a 6 M di guanidinio cloridrato o 8-10 M di urea. Dopo l’incubazione per 1 ora a temperatura ambiente sufficiente, passare la causa attraverso la loro colonna di dissalazione PD-10 o NAP-5 precedentemente equilibrata con un intasamento degassato (20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, tampone ph, 8.0). Vorranno aiutarti a lavorare il più rapidamente possibile ed evitare l’ossidazione dell’aria. Di solito lavoriamo in un vano portaoggetti così come nei materiali inerti circostanti. La tua proteina appena trasportata sarà all’interno delle parti previste dal produttore della colonna. Fai attenzione a non contaminare la cavità dentale contenente le tue proteine ​​con la maggior parte contenente DTT.

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