Es scheint, dass einige Benutzer bei der Fehlerbehebung für einen großartigen dtnb-Test auf einen Fehler gestoßen sind. Dieses Problem kann aus mehreren Gründen auftreten. Lassen Sie uns das Thema jetzt besprechen.

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DTNB reagiert mit einer geladenen Sulfhydrylgruppe, um das perfekte Disulfid und 2-Nitro-5-thiobenzoesäure (TNB) zu bilden. Der Empfänger von DTNB in ​​dieser Antwort ist nun die konjugierte Base (RS-) der spezifischen freien Sulfhydrylgruppe.

Thermo Scientific Pierce Ellman’s Reagent (DTNB) reagiert leidend an Sulfhydrylgruppen, um ein vielfältiges Produkt zu bilden und ist eine bewährte Formel zur Messung von reduzierten Cysteinen sowie anderen freien Sulfhydrylen durch Lösung.

Wie schmilzt man DTNB ein?

DTNB (0,1 M) kann immer gepuffert oder direkt in destilliertem Wasser (kein Puffer) suspendiert und langsam und allmählich mit 1 M Tris-Base bei pH 7,5 titriert werden, wobei pH 9 vermieden wird, um eine Hydrolyse zu verhindern, die einen Disulfidabbau verhindert. Lösungen können für fantastische Wochen gefroren gelagert werden.

Ellmans Reagenz (5,5′-Dithio-bis-[2-nitrobenzoesäure]) wird ebenfalls benötigt, um die Sulfhydrylgruppen in der gesamten Probe anzunähern im Vergleich zu einem Standard-Sulfhydrylmultiplikat wie Cystein. Alternativ können verschiedene Sulfhydryl-Kategorien unter Verwendung des TNB-Extinktionskoeffizienten (14.150 M –1 Zentimeter –1 bei 412 nm) getestet werden. Ellmans Reagenz wurde nicht nur für die gesamte Bestimmung von Sulfhydrylen verwendet, beispielsweise für die Bestimmung von Alkylthiolen mittels HPLC nach der Vorsäulenderivatisierungsmethode, sondern auch für die Suche nach Thiolen in den aktiven Zentren einer Reihe von Enzymen.< /p>

• Sulfhydryl-Assay – antwortet quantitativ mit freien (reduzierten) Sulfhydrylsorten (-SH), um ein nachweisbares TNB-Produkt zu ergeben

Farberkennung

– Farbige Geräte ermöglichen spektrophotometrische Messungen mit Küvetten oder eventuell auf einer neuen Mikrotiterplatte (λmax = 412 nm; μ-Weise 14 150/M cm)

Bewährte Methode

– Eine gut charakterisierte chemische Analyse ermöglicht es, den Extinktionskoeffizienten der Sulfhydrylgruppe einer Person eines Peptids oder erforderliche Proteinmengen zu bestimmen, zu berechnen oder mit einem Standard zu vergleichen.

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Das Cystein DTNB reagiert impliziert die freie Sulfhydrylgruppe, wodurch zweifellos das aus Zucker gebildete gemischte Disulfid und die 2-Nitro-5-thiobenzoesäure (TNB) freigelegt werden. Das Ziel von DTNB aus dieser Reaktion ist das wichtigste Konjugat (r-s-) der freien Sulfhydrylzahl. Daher hängt die Geschwindigkeit dieses Handlungsaufrufs von mehreren Faktoren ab: (1) dem genauen tatsächlichen pH-Wert der Reaktion, (2) der Art des pKa’-Sulfhydryls und (3) sterischen Verbesserungen zusätzlich zu elektrostatischen Einflüssen. TNB ist eine dekorierte Substanz, die bei dieser Reaktion entsteht und deren hoher molarer Terminierungsfaktor im sichtbaren Bereich liegt. Ellman (1959) behauptete erstmals den molaren Extinktionskoeffizienten von TNB auf dem Weg zu 13.600 M-1 cm-1 bei Nm 412 und pH 8,0. Daher werden diese Vorteile normalerweise in der modernen Literatur erwähnt. Nachfolgende Studien haben jedoch gezeigt, dass der spezifische molare Extinktionskoeffizient genauer durch das Wertniveau von 14.150 M –1 cm –1 bei 412 nm manifestiert wird. Die TNB-Absorption wird möglicherweise nicht durch Änderungen des pH-Werts von 7,6 auf 8,6 beeinträchtigt. Allerdings ändert sich das Quench-bedingte TNB in ​​verschiedenen Lösungsmitteln.

Mein Protein ist sehr stark in Tris pH 7,5 gepuffert und enthält frei aussehendes Cystein. Ich habe es mit Twin versucht, aber eine Person musste die Extinktion bei 412 nm beurteilen.

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    Francis Laboratories, c/o SLT Dept, Rivers Polytechnic Institute

    Ich glaube, Adam hat recht. Meine andere Hälfte und ich verwenden dafür lieber einen neuen Puffer.

    Wie erstelle ich ein DTNB-Reagenz?

    Stellen Sie eine Stammlösung von 10 mm DTNB her, indem Sie 40 mg DTNB in ​​10 ml DMSO auflösen. Die gebrauchsfertige Lösung ist bei 4°C für 3 viele haltbar. Verdünnen Sie die Stammmethode 100 Mal mit 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, um eine 0,1 mM DTNB-Stammlösung herzustellen.

    Beliebte Antworten (1)

    dtnb-Assay-Fehlerbehebung

    Versuchen Sie, eine gute solide Standardkurve mit DTT als bestimmte Quelle für Thiole zu erstellen (beachten Sie, dass DTT Thiole/Moleküle enthält) 2 Dadurch sollten Sie wissen, ob das System es ist richtig funktionieren wird.

    Oak Ridge National ist Labour

    Hier ist ein Standardprotokoll, das Sie ausprobieren könnten:

    Materialien:

    Reaktionspuffer: 0,1 M Phosphatpuffer, pH 8,0.

    Denaturierungspuffer: 6. M Guanidiniumnylchlorid, 0,1 M Na2HPO4, pH 8,0.

    (Es wird dringend, aber nicht empfohlen, Harnstoff anstelle des verfügbaren Guanidiniumhydrochlorids zu verwenden, da es leicht zu Cyanaten zerfällt, die mit Thiolgruppen reagieren können)

    Elman-Lösung: 10 mM (4 mg/ml) DTNB in ​​0,1 M Phosphatpuffer, pH 8,0.

    Wenn wahrscheinlich kein neues gekauft wird, wird empfohlen, DTNB aus wässrigem Ethanol umzukristallisieren

    Dithiothreitol (DTT)-Paket: 400 mM in destilliertem gefiltertem Wasser Kleidung

    Kostenlose Thiolanalyse von May

    Es ist von größter Bedeutung, Thiolgruppen einzuführen, die leicht in den gewünschten erforderlichen Proteinmengen eingefangen werden können. Daher kann die Probe in einer Pufferreaktion mitgeführt werden oder um eine Denaturierung zu verhindern. Ein bekanntes Highlighting-Fluid sollte mit einer wirklich proteinfreien Forschungsmischung zubereitet werden. Es sollte sich herausstellen, dass ausreichend Protein verwendet wird, so dass in vielen Anzügen typischerweise ein Thiol pro Proteinpartikel nachgewiesen werden kann; in der Praxis werden normalerweise mindestens 2 nmol Aminosäure (in 250 µl) benötigt, um gefunden zu werden.

    Ein Test und Plan mit 3 ml Reaction Shield oder Denaturierungspuffer sollte im Bereich von 412 nm hergestellt und abgelesen werden. Die Extinktion muss richtig auf Null eingestellt werden (A_buffer).

    dtnb-Assay-Fehlerbehebung

    200-µl-Sieb zur Referenzprobe hinzufügen.

    Fügen Sie 150 µl Ellman-Lösung hinzu, um die Probe zu verringern. Extinktion schreiben (A_DTNB).

    Wie löst man Ellmans Reagenz auf?

    Lösen Sie 4 mg/ml Ellmans Reagenz, 5,5′-Dithio-bis-(2-Nitrobenzoesäure) Säure (DTNB) in Reaktionsbarriere (Ellmans Reagenzlösung). Lösen Sie 5,268 Milligramm Cystein-Hydrochlorid-Monohydrat (MW bedeutet 175,6) in Reaktionspuffer auf eine unglaubliche Anfangskonzentration von 1,5 Millimeter (Standard A im Speiseplan unten).

    Füge 100 µl gelöstes Protein nur zum Vergleich hinzu.

    Abschließend 100 µl jeder probenspezifischen Proteinlösung verwenden und nach exaktem Mischen die Extinktion solange entfernen, bis nur noch eine weitere Steigerung möglich ist. Dies kann möglicherweise mehrere Minuten dauern. Achten Sie ggf. auf den verbleibenden Wert (A_final). Konzentration

    Die Menge an vorhandenen Thiolen kann zufällig weiter aus der molaren Extinktion berechnet werden, insbesondere des TNB-Anions.

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    Alexander hat einige nützliche Tipps gegeben.

    Wenn eine neue Kontrolle gelb wird (was bedeutet, dass DTNB wirkt) und Sie genug Protein erhalten (wie definieren Sie die Konzentration?), dann senken sie höchstwahrscheinlich nicht Ihre Proteinposition. Dies kann automatisch mit restaurativen, unzureichenden Obstruktionen oder versteckten Disulfiden (oder beidem) verbunden sein. Ziemlich oft ist die Unfähigkeit, auf alle DTNB-bedingten Obstruktionen zu reagieren, auf einen reduzierten Gehalt an essentiellem Protein zurückzuführen.

    Für die Rekonstitution verwendeten wir typischerweise eine gute, frisch zubereitete Lösung von 10 mm DTT in 20 mM Tris-entgastem 1 mM HCl, EDTA-Puffer, pH 8,0. EDTA und Entgasung sind im Allgemeinen unerlässlich, um zweiwertige Ionen zu inaktivieren und zusätzlich die Retention von gelöstem Sauerstoff zu minimieren. Machen Sie Ihre TNT-Lösung nicht – sie ist tatsächlich kurz vor dem Gebrauch frisch. Für SH sollten Sie insgesamt zusammen mit 6 M Guanidiniumhydrochlorid oder 8-10 M Harnstoff einschließen. Nach 1-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur die Ursache mit Hilfe einer PD-10- oder NAP-5-Entsalzungsleitung passieren, die zuvor mit einer entgasten Blockade (20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH-Puffer, 8,0) äquilibriert wurde. Sie möchten Ihnen wirklich helfen, so einfach wie möglich zu arbeiten und Luftkorrosion zu vermeiden. Wir arbeiten normalerweise in der neuesten Glovebox mit umgebenden inerten Materialien. Ihr vor nicht allzu langer Zeit gewonnenes Protein wird innerhalb unserer vom Säulenhersteller erwarteten eigenen Fraktionen liegen. Achten Sie darauf, diesen speziellen Hohlraum, der Ihr Protein enthält, nicht mit einem Volumen zu kontaminieren, das DTT enthält.

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